Análise de ascos ordenados em Neurospora crassa

              O fungo filamentoso Neurospora crassa apresenta reprodução assexuada com produção de conídios de cor alaranjada. Na ausência de certos nutrientes (principalmente fontes de nitrogênio) é iniciada a fase sexuada. Indivíduos de N. crassa podem ser de dois tipos: A ou a de acordo com o tipo de acasalamento (loco mating-type). O acasalamento só ocorre entre indivíduos A e a. Como resultado do acasalamento são formados corpos de frutificação chamados peritécios. No interior do peritécio estão os ascos que contém os esporos (ascósporos), resultantes do acasalamento, arranjados de maneira linear. Devido à forma do asco, os fusos não se sobrepõem durante a meiose. Assim, o arranjo de ascósporos geneticamente diferentes representam os eventos que ocorreram na meiose. Ao final da meiose, uma mitose ocorre e oito ascósporos, ao invés de 4, são produzidos em cada asco.

            A mutação cys-3 em N.crassa além de causar auxotrofia para cisteína faz com que os ascósporos, que são normalmente escuros, permaneçam claros. Assim, de um cruzamento de uma linhagem selvagem com uma linhagem cys-3, metade dos ascósporos serão pretos e metade brancos. O arranjo dos ascósporos dentro do asco vai indicar se houve ou não permuta genética (crossing-over) entre o gene cys-3 e o centrômero (ver figura 1). Se houver crossing-over os ascos terão arranjo tipo 2:2:2:2 (recombinantes). A proporção de ascos sem crossing-over (parentais) e recombinantes nos permite calcular a freqüência da recombinação entre o gene cys-3 e o centrômero (e conseqüentemente a distância entre eles em unidades de mapa). Outros genes que não possuem um marcador de cor podem ser mapeados através do cultivo de cada ascósporo individualmente, mantendo a seqüência observada no asco e posterior análise do seu fenótipo.

Instruções:

            As linhagens de N. crassa fl matA e mutante cys-3 mata serão utilizadas.

1.     Crescer a linhagem fl matA em placa com meio Westergaard (baixa concentração de nitrogênio) a 25ºC por 5-10 dias para produção de protoperitécios.

2.     Espalhar uma solução de conídios da linhagem cys-3 mata sobre a cultura A com uma alça de Drigalsky. Incubar de 7 a 15 dias a 25ºC para aparecimento e amadurecimento dos peritécios.

3.     Com uma pinça ou agulha retirar 4-5 peritécios da placa, partindo-os ao meio e depositar o seu conteúdo em uma gota d’água contida sobre uma lâmina. Colocar a lamínula sobre a gota e pressionar levemente (uma alternativa é esmagar os peritécios com a própria lamínula).

4.     Observar os agrupamentos de ascos (rosetas) ao microscópio e classificar cerca de 200 ascos quanto ao tipo. Não considerar os ascos com esporos totalmente claros (imaturos).

5.     Calcular a freqüência de recombinação entre o gene cys-3 e o centrômero, através da fórmula:

% recombinação = número de ascos recombinantes  x 100

                                    número total de ascos x 2 

            A freqüência de recombinação dará a você um número referente a unidades de mapa (ou cM).

Questões: 

• Desenhe um esquema da estrutura dos cromossomos envolvidos na meiose para explicar todos os tipos de recombinantes possíveis.
• Por que a fórmula acima tem um 2 no denominador?
• Se você observou algum asco diferente dos esperados acima, qual a explicação provável para este fato?
• Como você poderia relacionar a distância genética (em unidades de mapa) com a distância física (em Kb)? Essa relação é precisa? Por quê?