Conjugação Bacteriana

Introdução

              A conjugação bacteriana, descoberta por Ledeberg e Tatum (1946), é o processo sexual de transferência de genes de uma bactéria doadora para uma receptora.

            Para que uma linhagem bacteriana seja doadora ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extracromossômico). O processo de conjugação foi descoberto em Escherichia coli K12 e o elemento responsável foi chamado de fator F (também chamado de plasmídio F). Este plasmídio pode estar ou não integrado no cromossomo da bactéria hospedeira. Quando integrado, a bactéria é chamada de HFr (alta freqüência de recombinação) devido à mobilização de genes cromossômicos no processo de conjugação desencadeado por produtos gênicos do plasmídio.

            A célula F+, durante o contato com um célula F-, transfere para esta última uma cópia do plasmídio F, tornando-a F+. A linhagem HFr, onde o fator F encontra-se integrado no cromossomo, transfere essencialmente marcadores localizados no cromossomo, sendo que apenas muito raramente a totalidade do fator F é transferida (conjuntamente com todo o cromossomo da doadora). Portanto, nesse caso a célula receptora permanece F- após a conjugação.

            Após a descoberta do fator F, outros plasmídios conjugativos foram descritos, como os plasmídios ou fatores R. Esses plasmídios têm esse nome genérico por conterem marcadores de resistência a drogas antibacterianas e em geral não se integram no cromossomo bacteriano.

            Neste experimento será usada a linhagem de E. coli portadora de plasmídio R. Para uma revisão sobre o assunto, consulte o DAVIS e col (1979), CHARTONE-SOUZA (1979), AZEVEDO (1977), HERSKOWITZ (1971) ou LEVINE (1977). 

Material: 

-        Escherichia coli BH100 (Lac⁺, resistente a ampicilina, canamicina, mercúrio, cloranfenicol e tetraciclina).

-        Escherichia coli K12 (Lac­^-, resistente à estreptomicina).

-        Soluções estoques de estreptomicina (300mg/ml), de tetraciclina (20µg/ml).

-        Agar BEM.

-        Caldo nutriente.

-        Tubos esterilizados.

-        Placas de petri esterilizadas.

-        Pipetas de 1 a 5 ml esterilizadas.

-        Alças de níquel cromo.

-        Espalhador de vidro (alça de Drigalsky).

-        Álcool.

Método: 

1)     Inocular em caldo nutriente células de E.coli BH100 e E.coli K12 (culturas separadas). Incubar a 37ºC, durante 18 a 24 horas.

2)     Colocar 0,2ml da cultura de E.coli BH 100 (doadora) e 0,8ml da cultura de E.coli K12 (receptora) em 4ml de caldo nutriente. Incubar a cultura mista a 37ºC, sem agitação durante 2 a 4 horas.

3)     Semear 0,1ml da cultura mista em uma placa de BEM contendo estreptomicina (300µg/ml) e tetraciclina (20µg/ml). Semear com alça de níquel cromo cada uma das culturas separadas nas placas controle:

EMB + estreptomicina, EMB + tetraciclina, EMB + estreptomicina + tetraciclina. Incubar a 37ºC, por 24 horas.

4)     Analisar os resultados.

Resultados, Discussão e Conclusão 

a)     Qual o número de transcojugantes total resultantes do experimento de conjugação?

b)    Explique a finalidade de cada uma das placas controle. Compare os resultados obtidos com o que seria esperado.

c)     Se você transferisse alguns transconjugantes para uma placa contendo EMB + tetraciclina, o que você acha que iria acontecer?

d)    Que conclusões você pode tirar deste experimento?

Bibliografia 

AZEVEDO, JL. 1997. Tópicos de Genética microbiana e molecular. Vol II. Genética de Procariotos. Piracicaba, SP. 207pp.

CHARTONE-SOUZA,E.1979. Quimotaxia entre linhagens doadoras e receptoras de plasmídio R em Escherichia coli. Tese de Doutoramento, ESALQ/USP – Piracicaba, SP. 112pp.

DAVIS,DG e DULBECCO,R. 1979. Microbiologia. Vol.1, 2ª ed. Editora Harper e Row do Brasil, 421pp.

HERKOWITZ, IH. 1971. Princípios Básicos de Genética Molecular. Companhia Editora Nacional. 340pp.

LEDERBERG, J e TATUM, EL. 1946. Gene recombination in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 112: 315-326.

LEVINE, L. 1977. Biologia do Gene. Ed. Edgard Blucher. 405pp.